همه چیز درباره‌ آزمایش FISH ؛ نگاهی به کاربردها، روش انجام و تفسیر نتایج

تست FISH چیست؟ (Fluorescence in situ Hybridization)

تست FISH یا هیبریداسیون فلورسانس در محل یک تکنیک تخصصی است که در آزمایش‌های ژنتیکی از آن برای تشخیص بیماری‌های ناشی از ناهنجاری‌های کروموزومی استفاده می‌شود. همچنین، از این روش برای شناسایی تغییرات ژنی مرتبط با برخی سرطان‌ها که می‌توان هدف درمان قرار داد نیز بهره می‌برند. در این روش، از پروتئین‌ها یا رنگ‌های شیمیایی خاص برای «رنگ‌آمیزی» بخش‌هایی از کروموزوم یا ژن‌ها استفاده می‌شود تا در زیر میکروسکوپ به صورت نورهای رنگی فلورسانس دیده شوند. ژن‌ها حاوی اطلاعاتی هستند که در قالب DNA ذخیره شده‌اند. این ژن‌ها روی ساختارهایی رشته‌ای به نام کروموزوم قرار دارند. اگر در این دستورالعمل‌ها مشکلی پیش بیاید، مثلاً بخش‌هایی از DNA حذف (deletion)، تکرار (amplification) یا جابجا (translocation) شوند، سلول‌ها دستور اشتباهی دریافت می‌کنند. این تغییرات می‌توانند باعث اختلال در عملکرد طبیعی بدن یا بروز بیماری‌هایی مانند سرطان شوند. توالی DNA در پروب FISH مکمل ناحیه مورد نظر است. اگر آن ناحیه در نمونه وجود داشته باشد، پروب به آن متصل (هیبرید) می‌شود و در میکروسکوپ فلورسانس قابل مشاهده است، که نشان‌دهنده‌ی حضور ژن یا سانترومر مورد نظر است. اما اگر ناحیه مورد نظر حذف شده باشد (deletion)، پروب به DNA هدف متصل نمی‌شود و در نتیجه دیده نخواهد شد. 

تست FISH برای چه مواردی استفاده می‌شود؟

تست FISH (فلورسانس درجا) بیشتر برای شناسایی تغییرات یا ناهنجاری‌های ژنتیکی در سطح کروموزوم‌ها و ژن‌ها به کار می‌رود. کاربردهای اصلی این روش عبارت‌اند از:
 - بررسی جهش‌های گسترده ژنی در سرطان‌ها؛ پزشکان از این تست برای تشخیص نوع سرطان یا انتخاب درمان هدفمند بر اساس تغییرات ژنی خاص استفاده می‌کنند.
 - تشخیص ناهنجاری‌های کروموزومی پیش از تولد یا پس از تولد؛ تست FISH می‌تواند برای شناسایی اختلالات کروموزومی در جنین یا نوزاد به کار رود.
 - بررسی ناهنجاری‌های کروموزومی در جنین طی مرحله لقاح آزمایشگاهی (IVF): در غربالگری ژنتیکی پیش از لانه‌گزینی (PGT)، از FISH برای بررسی سلامت کروموزومی جنین قبل از انتقال به رحم استفاده می‌شود.

نحوه عملکرد تست FISH (فلورسانس درجا)

تست FISH مانند این است که بخش‌های مهمی از "دفترچه راهنمای ژنتیکی بدن" را با ماژیک هایلایت علامت بزنیم تا متخصص بتواند ناهنجاری‌های ژنی را ببیند. در این روش، دانشمندان رشته‌های خاصی از DNA را با رنگ‌های فلورسانس علامت‌گذاری می‌کنند. این رشته‌ها که به آن‌ها پروب (Probe) گفته می‌شود، به بخش‌های خاصی از DNA هدف متصل می‌شوند و در زیر میکروسکوپ، به‌صورت نقاط رنگی درخشان دیده می‌شوند. زمانی که پروب‌ها به DNA هدف متصل شوند (فرآیند Hybridization)، متخصص با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس می‌تواند مشاهده کند: کدام بخش از DNA وجود دارد یا حذف شده است، آیا ژن خاصی چند برابر (Amplified) شده، یا بخشی از کروموزوم جابه‌جا شده است (Translocation).

تغییرات ژنی قابل شناسایی با روش FISH

پاتولوژیست‌ها می‌توانند از آزمایش FISH (فلورسانس در محل) برای بررسی سلول‌ها و شناسایی تغییرات ژنی استفاده کنند که عامل بروز برخی سرطان‌ها یا سایر بیماری‌های ژنتیکی شناخته می‌شوند. از این روش گاهی برای تأیید یا تفسیر دقیق‌تر نتایج کاریوتایپینگ (Karyotyping) نیز استفاده می‌شود. از جمله تغییرات ژنتیکی خاصی که آزمایش FISH قادر به شناسایی آن‌هاست می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

تکثیر ژن‌ها (Amplifications):
تکثیر به حالتی گفته می‌شود که تعداد نسخه‌های یک ژن بیشتر از حد طبیعی باشد.
مشابه حالتی که در آن تعداد کروموزوم‌ها بیش از حد معمول است، دانشمندان می‌توانند با استفاده از روش FISH بررسی کنند که آیا ژن خاصی در سلول‌ها بیش از حد مورد انتظار تکرار یا تکثیر شده است یا خیر.

جابجایی یا بازآرایی (Translocations / Rearrangement):

جابجایی یا بازآرایی به حالتی گفته می‌شود که بخشی از یک ژن یا کروموزوم به محل دیگری منتقل شده باشد. برای شناسایی این تغییر، دانشمندان از دو پروب با رنگ‌های متفاوت استفاده می‌کنند. در یک ژن طبیعی، این دو رنگ باید در کنار یکدیگر دیده شوند. اما اگر جابجایی (Translocation) رخ داده باشد، رنگ‌ها از هم جدا ظاهر می‌شوند. این جدایی نشانه‌ای از وقوع بازآرایی در ساختار ژن یا کروموزوم است.

حذف‌ها (Deletions):
در حذف‌های ژنی، بخشی از اطلاعات DNA از بین رفته یا حذف شده است. مشابه با روش تشخیص جابجایی‌ها، دانشمندان برای شناسایی این نوع تغییر از چندین پروب (کاوشگر) استفاده می‌کنند تا بخش‌های خاصی از DNA را بررسی کنند. اگر برخی از پروب‌ها به ناحیه مورد نظر متصل شوند اما بقیه نتوانند در محل طبیعی خود بچسبند، نشان‌دهنده‌ی آن است که بخشی از DNA در آن نقطه وجود ندارد. به بیان ساده، وقتی ناحیه‌ای از DNA علامت‌گذاری نمی‌شود، به معنای حذف شدن آن بخش از اطلاعات ژنتیکی است.

ارائه‌دهندگان خدمات سلامت می‌توانند از FISH برای شناسایی تغییرات ژنی استفاده کنند که در تشخیص موارد زیر کاربرد دارند:

 - لنفوم (Lymphoma)

 - انواع لوسمی (Leukemia) مانند لوسمی میلوئیدی حاد و مزمن (AML و CML)

 - مولتیپل میلوما (Multiple Myeloma)

 - سرطان مثانه (Bladder Cancer)

 - گلیوما (Glioma) – نوعی تومور مغزی

 - مزوتلیوما (Mesothelioma) – سرطان پرده جنب ریه

 - تکثیر ژن HER2 (در سرطان پستان، معده یا ریه)

 - تکثیر ژن MET (در سرطان‌های ریه، معده و مری)

 - تکثیر ژن MYCN در نوروبلاستوما (سرطان کودکان)

 - بازآرایی یا همجوشی ژن‌های ALK، RET و ROS1 در سرطان ریه سلول غیرکوچک (NSCLC)

این تغییرات ژنتیکی می‌توانند مسیر درمان را مشخص کنند، زیرا برخی از آن‌ها به داروهای هدفمند خاص پاسخ می‌دهند.

چگونه باید برای انجام آزمایش FISH آماده شوم؟

ارائه‌دهندگان خدمات سلامت نمونه‌ای را برای تحلیل FISH بررسی می‌کنند. آمادگی شما برای انجام این آزمایش بستگی به نوع نمونه‌ای دارد که پزشک از شما نیاز دارد:

برای آزمایش‌های پیش از تولد (prenatal testing)، پزشک شما آمنیوسنتز انجام می‌دهد.

برای آزمایش‌های پیش‌ از لانه گزینی (Preimplantation Genetic Diagnosis - PGD یا Preimplantation Genetic Screening - PGS)، پزشک چند سلول از جنین‌ها را پیش از کاشت بررسی می‌کند. این کار معمولاً چند روز پس از برداشت تخمک انجام می‌شود.

اگر پزشک مشکوک باشد که شما یا فرزندتان دچار بیماری ناشی از ناهنجاری کروموزومی یا جهش ژنی هستید، می‌تواند از طریق آزمایش خون آن را بررسی کند.

برای تشخیص سرطان یا جهش‌های ژنی در سلول‌های تومور (آزمایش‌های مولکولی)، انجام نمونه‌برداری از تومور یا مغز استخوان (بیوپسی) لازم است.

به‌طور کلی، تنها آزمایشی که ممکن است نیاز به آمادگی خاصی داشته باشد بیوپسی است. از آنجا که بسیاری از بیوپسی‌ها تحت بیهوشی انجام می‌شوند، باید دقیقاً طبق دستور پزشک خود عمل کنید.

پاتولوژیست یا تکنسین بخش سیتوژنتیک مولکولی چگونه آزمایش Fluorescence in situ Hybridization (FISH) را انجام می‌دهند؟

برای انجام تحلیل FISH، متخصص آسیب شناسی یا تکنسین آزمایشگاه مراحل زیر را طی می‌کند:

طراحی پروب (Probe):

در این مرحله بخش‌هایی از DNA انتخاب می‌شوند که با توالی مورد نظر مطابقت دارند. سپس در DNA برش‌های کوچکی ایجاد کرده و برچسب‌های فلورسنت به آن اضافه می‌کنند.  آزمایش FISH فرآیندی نسبتاً ساده است که در آن یک پروب DNA دو رشته‌ای نشاندارشده با فلورسانس به نمونه سلولی شما (مانند مغز استخوان، خون محیطی) یا بافت‌های ثابت‌شده در پارافین (FFPE) مانند بافت پستان، ریه یا عضله یا ... یا به طور خاص‌تر، به DNA هدف، اضافه می‌شود.

آزمایش FISH بر روی نمونه‌های سلولی:
در گام نخست، نمونه برای انجام FISH کشت، برداشت و فیکس می‌شود تا تقسیم سلولی متوقف گردد. همچنین باید توجه داشت که FISH می‌تواند بر روی نمونه‌های بدون کشت مانند خون، مغز استخوان یا سلول‌های آمنیوسیت نیز انجام شود.

دناتور کردن پروب و نمونه (Denaturation):

مرحله دوم در آزمایش FISH شامل دناتوراسیون (جدا کردن دو رشته DNA) در نمونه سلولی یا بافتی به همراه پروب FISH است. در این مرحله پروب‌ها و نمونه به گونه‌ای رسیدگی می‌شوند که دو رشته‌ی DNA از هم جدا شوند. در این مرحله، نمونه و پروب با هم تا دمای ۷۵ درجه سانتی‌گراد (با تلورانس ±۱ درجه) حرارت داده می‌شوند تا رشته‌های DNA از هم جدا شوند و پروب نشاندارشده با فلورسانس بتواند به DNA هدف دسترسی پیدا کند.

هیبریداسیون (Hybridization):

هنگامی که پروب‌ها با نمونه DNA از بافت یا مایع بدن ترکیب می‌شوند، به بخش‌هایی از DNA که توالی مورد نظر را دارند متصل می‌گردند. در این مرحله، اسلاید حاوی نمونه سلولی یا بافتی در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد (با تلورانس ±۱ درجه) و در یک محیط مرطوب برای مدت زمان مشخص، معمولاً طی شب (حدود ۱۶ ساعت)، نگهداری می‌شود تا پروب فلورسانس بتواند به DNA هدف متصل شود. در پایان مرحله‌ی هیبریداسیون، باید اسلاید نمونه را دو بار شست‌وشو دهید تا پروب‌های اضافی یا غیر‌اختصاصی از بین بروند.
شست‌وشوی اول: در محلول 0.4xSSC در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد به‌مدت ۲ دقیقه انجام می‌شود.
شست‌وشوی دوم: در محلول 2xSSC حاوی 0.05% Tween-20 در دمای اتاق به‌مدت ۳۰ ثانیه انجام می‌شود.
سپس، پس از پایان شست‌وشوها، یک رنگ فلورسانس DNA مانند DAPI روی اسلاید اضافه می‌شود تا هسته‌های بین‌مرحله‌ای (interphase nuclei) و کروموزوم‌های متافازی به‌صورت واضح‌تر زیر میکروسکوپ فلورسانس قابل مشاهده باشند.

بررسی نتایج:

در مرحله‌ی نهایی، باید نمونه‌ی سلولی یا بافتی را با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس بررسی کنید. این میکروسکوپ باید مجهز به فیلترهای مختلف باشد، از جمله:
DAPI، Texas Red، FITC (فلوروفور سبز)، Orange، Gold و Aqua.
این فیلترها می‌توانند به‌صورت تکی یا ترکیبی (دوگانه یا سه‌گانه) استفاده شوند. در این مرحله، باید سیگنال‌های فلورسانس حاصل از پروب‌ها را شناسایی کرده و الگوهای رنگی مختلف را شمارش کنید. در نمونه‌ها یا بافت‌های طبیعی (بدون ناهنجاری ژنتیکی)، معمولاً در هر سلول قابل‌تحلیل دو سیگنال از رنگی که پروب با آن نشانه‌گذاری شده است دیده می‌شود. اما در نمونه‌های غیرطبیعی (بیماران دارای ناهنجاری ژنتیکی)، الگوی رنگی متفاوتی مشاهده می‌شود که بسته به نوع بیماری تغییر می‌کند. برای بررسی دقیق الگوهای مورد انتظار، باید به راهنمای محصول (IFU) پروب مورد استفاده مراجعه کرد. همچنین، تعداد سلول‌های مورد بررسی ممکن است بر اساس نوع نمونه، علت ارجاع و دستورالعمل‌های داخلی آزمایشگاه متفاوت باشد.

در پایان، نتایج آزمایش FISH به پزشک معالج گزارش می‌شود.

نتایج و پیگیری‌ها

چه نوع نتایجی از آزمایش FISH دریافت می‌شود؟

نوع نتیجه‌ای که از آزمایش FISH به دست می‌آید، به نوع آزمایشی که انجام داده‌اید بستگی دارد.
نتیجه‌ مثبت (Positive) در آزمایش FISH به این معناست که سلول‌های نمونه دارای ناهنجاری کروموزومی یا ژنی هستند. از پزشک خود بپرسید که چه نوع نتیجه‌ای باید انتظار داشته باشید و معنای آن چیست.

اگر نتیجه آزمایش FISH مثبت باشد چه می‌شود؟

اگر نتیجه آزمایش شما مثبت باشد، پزشک به شما کمک می‌کند تا مفهوم آن و گزینه‌های بعدی را درک کنید. اگر آزمایش برای تغییرات ژنی مرتبط با سرطان انجام شده باشد، ممکن است گزینه‌های درمانی هدفمند برای آن جهش خاص وجود داشته باشد.

چه زمانی نتایج آزمایش FISH آماده می‌شود؟

نتایج آزمایش FISH معمولاً بین یک تا سه هفته آماده می‌شود. پزشک شما اطلاع می‌دهد که چه زمانی می‌توانید منتظر نتایج باشید و به چه روشی آن‌ها را دریافت خواهید کرد.

یادداشت پایانی

انتظار برای دریافت نتایج آزمایش‌های ژنتیکی می‌تواند باعث اضطراب، ترس یا نگرانی شود، یا شاید فقط مشتاق باشید که بالاخره پاسخی به دست آورید. آزمایش FISH روشی است که پاتولوژیست‌ها برای کمک به شما در یافتن همین پاسخ‌ها به کار می‌برند؛ مانند هایلایتری که دقیقاً بخش‌های مهم اطلاعات ژنتیکی شما را مشخص می‌کند. حتی اگر نتایج آن چیزی نباشد که انتظارش را داشتید، باز هم به شما کمک می‌کند تا درک بهتری از وضعیت خود و گزینه‌های درمانی‌تان داشته باشید. از آنجا، شما و پزشکتان می‌توانید برنامه‌ای مناسب برای ادامه مسیر تنظیم کنید. فراموش نکنید در صورت داشتن هرگونه سؤال درباره آزمایش، هدف آن یا نتایجش، حتماً با پزشک خود مشورت کنید.

Reference: clevelandclinic.org / ogt.com